研究某種蛋白和濕面筋凍藏穩(wěn)定性的關(guān)系
小麥面筋蛋白是一種黃白色有彈性和延伸性的物質(zhì)，主要由麥醇溶蛋白和麥谷蛋白組成，面筋蛋白吸水后，蛋白分子逐漸水化，分子間相互作用形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，賦予面團(tuán)持水性、面團(tuán)黏結(jié)性與黏彈性等流變學(xué)性質(zhì)。冷凍是已被廣泛應(yīng)用的一種食品保存方法，但在冷凍貯藏過程中，因溫度波動(dòng)而引起的重結(jié)晶現(xiàn)象可引起濕面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)物化性質(zhì)的改變，尤其凍結(jié)水形成冰晶后體積增加，表現(xiàn)出異常的膨脹特性，使得蛋白質(zhì)的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受到擠壓而破壞。關(guān)于濕面筋蛋白凍融穩(wěn)定性方面的研究是冷凍面團(tuán)及其制品體系基礎(chǔ)研究的重要部分，具有實(shí)踐指導(dǎo)意義。
2006年，我國(guó)衛(wèi)生部公布冰結(jié)構(gòu)蛋白所示。隨凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)，濕面筋蛋白樣品融化焓值均呈增大趨勢(shì)，即表明冷凍濕面筋蛋白中可凍結(jié)水量增加�？瞻讟悠吩趦霾貢r(shí)間為1周時(shí)，冰的融化焓為88.5J/g，比Kontogiorgos等得出的值要小些，這可能是因?yàn)槊娼畹鞍椎膩碓匆约懊娼詈退谋壤灰恢略斐傻�。凍�?周后，融化焓值為96J/g，增加了8.4%，而當(dāng)凍藏時(shí)間達(dá)到9周時(shí)，融化焓達(dá)到112.5J/g，與第1周相比，焓值增加了27.1%。開始時(shí)水分的遷移和可凍結(jié)水的增加，可能是因?yàn)樵谳^低溫度下濕面筋蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞；當(dāng)凍藏時(shí)間為9周時(shí)，可凍結(jié)水焓值又有所增加，這可能是因?yàn)樵陂L(zhǎng)時(shí)間凍藏過程中，冰晶的重結(jié)晶效應(yīng)導(dǎo)致濕面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞程度增加，使得水分從網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中離析出來，可凍結(jié)水量增加。
加入冰結(jié)構(gòu)蛋白后，凍藏1周冰的融化焓為83.4J/g，比空白樣品降低了4.9%，而凍藏9周融化焓達(dá)到103.3J/g，比空白樣品降低了 8.9%，總的看來，加入 ISP 后，隨著凍藏時(shí)間的增加，冰的融化焓仍是增加的，但是在凍藏時(shí)間相同時(shí)，含ISP 的面筋蛋白冰融化焓值要明顯小于空白樣品，這是因?yàn)楸Y(jié)構(gòu)蛋白在范德華力、疏水相互作用和氫鍵作用下吸附到面筋蛋白體系中冰核表面，抑制冰核生長(zhǎng)即抑制重結(jié)晶，減小了冰晶對(duì)濕面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的破壞，從而減少了從網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中離析出的水分。
2.2 流變學(xué)特性變化
運(yùn)用動(dòng)態(tài)流變儀對(duì)樣品進(jìn)行頻率掃描，研究其彈性模量和黏性模量的變化，即對(duì)樣品施加相同的應(yīng)力，研究振蕩頻率對(duì)彈性模量和黏性模量的影響。此方法可以在不破壞樣品結(jié)構(gòu)的情況下，直接獲得與樣品的彈性和黏性行為相關(guān)的信息。
蠕變曲線分為3個(gè)主要的階段：1)瞬時(shí)彈性形變：在施加應(yīng)力的-瞬間體系所發(fā)生的瞬時(shí)形變，在此階段，如果應(yīng)力除去，體系的形變會(huì)立即恢復(fù)；2)延遲彈性形變：緊接著體系的彈性形變開始緩慢增加；3)平衡形變：此時(shí)體系的彈性和黏性達(dá)到平衡，形變速率恒定。蠕變實(shí)驗(yàn)中，凍藏4周后面筋蛋白的形變明顯增加，這表明面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞。當(dāng)加入 ISP 時(shí)，面筋體系的形變量明顯減小，表明加入ISP 有效的保護(hù)了賦予面筋彈性的組分，即麥谷蛋白。Singh 等提出麥谷蛋白大聚體之間的纏繞產(chǎn)生的阻力抵抗變形和減慢滑移速率，纏繞點(diǎn)的數(shù)目決定于蛋白大聚體的長(zhǎng)度和相對(duì)分子質(zhì)量大小。因凍藏過程中形成的大冰晶可以破壞面筋蛋白之間的纏繞點(diǎn)，進(jìn)而使得面筋蛋白的抗變形能力變差，引入 ISP 后，因其可以吸附到冰晶表面，有效抑制冰晶的生長(zhǎng)和重結(jié)晶，減少對(duì)面筋蛋白結(jié)構(gòu)的破壞，可以提高其抗變形能力。
2.3 微觀結(jié)構(gòu)研究
圖5分別是空白濕面筋蛋白和添加ISP的濕面筋蛋白凍藏 1、4、9 周后的掃描電鏡顯微照片，圖 5A 說明空白樣品凍藏 1 周，便有粒徑小的不規(guī)則空洞出現(xiàn)，說未添加ISP9 周ing protein，ISP)即抗凍蛋白是可用于冷凍食品中的新型食品添加劑，可以被多種生物如魚類，植物及昆蟲所合成，以保證它們?cè)诘蜏叵驴梢陨�。ISP有3種主要功能：熱滯活性、修飾冰晶及抑制重結(jié)晶。在國(guó)內(nèi)率先對(duì)ISP在冷凍面團(tuán)體系中的應(yīng)用研究進(jìn)行了報(bào)道。關(guān)于 ISP 在冷凍面團(tuán)及其食品體系中的研究正在成為烘焙與發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域的熱點(diǎn)課題之一 。
本實(shí)驗(yàn)采用差示掃描量熱儀研究?jī)霾貢r(shí)間對(duì)濕面筋蛋白中可凍結(jié)水含量的影響；用動(dòng)態(tài)流變儀研究冷凍濕面筋蛋白的黏彈性模量隨凍藏時(shí)間的變化；采用掃描電子顯微鏡觀察不同凍藏時(shí)間下冷凍濕面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而分析濕面筋蛋白中冰 - 水相平衡的變化及冰結(jié)構(gòu)蛋白影響濕面筋蛋白凍藏穩(wěn)定性的作用機(jī)制，為冷凍面制品的研究提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料
冰結(jié)構(gòu)蛋白(ISP) ；面筋蛋白。
1.2 儀器與設(shè)備
面筋指數(shù)測(cè)定儀；差示量熱掃描儀；掃描電子顯微鏡；冷凍干燥機(jī)美國(guó)；動(dòng)態(tài)流變儀；蛋白質(zhì)測(cè)定儀。
1.3 方法
1.3.1 樣品制備
稱取一定量的小麥面筋蛋白粉與蒸餾水，利用面筋指數(shù)測(cè)定儀按質(zhì)量比1：1 的比例混合均勻，將制得的濕面筋蛋白用保鮮膜包裹，放在常溫下穩(wěn)定1h，然后切成圓片，用保鮮膜包裹放在－18℃冰箱中。
1.3.2 可凍結(jié)水含量測(cè)定
用銦和錫校準(zhǔn)差示掃描量熱儀。用剃刀從冷凍濕面筋蛋白圓片中心部位取10～15mg，密封在小鋁盒中，放入DSC，空氣作參比。在－15℃和5℃各保持5min，從－15℃升溫到5℃，升溫速度為 1℃/min。記錄可凍結(jié)水的焓變(ΔH)。
1.3.3 動(dòng)態(tài)流變學(xué)實(shí)驗(yàn)
測(cè)定條件：直徑20mm、偏角1°椎板，溫度25℃，頻率范圍0.01～100rad/s，應(yīng)變量10%，測(cè)定貯能模量G′及損耗模量 G′′隨頻率(0.01～100rad/s)的變化。
1.3.4 冷凍濕面筋蛋白微觀結(jié)構(gòu)觀察
借用蛋白質(zhì)測(cè)定儀，嚴(yán)格取冷凍濕面筋蛋白樣品30g，在30℃解凍2h后進(jìn)行冷凍干燥。樣品先用2.5% 戊二醛固定，0.1mol/L 磷酸緩沖液漂洗，再用1% 四氧化二鋨固定，0.1mol/L 磷酸緩沖液沖洗，用30%、50%、70%、90%、100% 乙醇梯度洗脫。用醋酸異戊酯置換出乙醇后，采用臨界點(diǎn)干燥法進(jìn)行干燥，經(jīng)離子濺射噴金后，置于掃描電子顯微鏡下觀察樣品結(jié)構(gòu)。加速電壓為5kV。
2 結(jié)果與分析
2.1 可凍結(jié)水含量研究面筋蛋白質(zhì)中水分子主要以結(jié)合水、可凍結(jié)結(jié)合水和自由水3 種狀態(tài)存在。所謂的可凍結(jié)水主要由自由水和可凍結(jié)結(jié)合水組成；所謂的非凍結(jié)水主要由結(jié)合水和另一部分松散的結(jié)合水組成。凍藏過程中，冰晶是破壞面筋蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的主要因素之一，而可凍結(jié)水含量決定了面團(tuán)在凍藏過程中冰晶的形成量，可凍結(jié)水越少，面筋的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)保持的越完整。可凍結(jié)水(冰)的含量可以通過計(jì)算 DSC 曲線峰值下的面積所測(cè)得的熔化焓值ΔH 來反映。圖1即為本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的典型冷凍用DSC測(cè)定冷凍濕面筋蛋白中可凍結(jié)水(冰)的含量。濕面筋蛋白中冰的融化焓隨凍藏時(shí)間的變化如圖明此時(shí)已經(jīng)有冰晶形成，隨著凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)，面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的空洞逐漸變大，可以看到游離的淀粉顆粒存在。由圖5C 可以看出空白樣品凍藏9周后，面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的空洞較大，說明重結(jié)晶形成的大冰晶對(duì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞程度較深。
圖5a為凍藏1周后含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5% ISP的濕面筋蛋白，與空白濕蛋白面筋蛋白(圖 5A)相比，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中雖然也有空洞出現(xiàn)，但空洞粒徑更小且均勻。凍藏4周后，即使加入 ISP，面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的空洞不可避免的大，面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞，但是遭受破壞的程度明顯小于未加ISP 的(圖5b)。當(dāng)凍藏時(shí)間延長(zhǎng)到9周時(shí)，添加ISP在一定程度上降低了濕面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭受破壞(圖5c)。這些結(jié)果說明引入 ISP 可以顯著抑制凍藏對(duì)濕面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的破壞。
冰晶形成以及重結(jié)晶效應(yīng)所產(chǎn)生的大冰晶對(duì)面筋網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生機(jī)械損傷是面筋網(wǎng)絡(luò)在凍藏過程中受到破壞的最主要原因之一。因ISP 可以抑制冰晶形成和重結(jié)晶，使得冷凍濕面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部和外部的可凍結(jié)水能夠形成相對(duì)較小且均勻的冰晶，降低對(duì)濕面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的破壞程度，從而提高冷凍面制品的品質(zhì)后可以抑制凍藏過程對(duì)濕面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的破壞。
綜上所述，冰結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)于提高濕面筋蛋白凍藏穩(wěn)定性有很好的效果，本實(shí)驗(yàn)為ISP 作為一種新型的添加劑，在冷凍面團(tuán)及冷凍面制品中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)研究信息 。
