光照強(qiáng)度對(duì)海洋綠藻脂和脂肪酸含量的影響
海洋微藻因富含AA、EPA和DHA等(n-3)PUFAs而備受關(guān)注。(n-3)PUFA的生理功能包括增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能、預(yù)防和治療多種心血管疾病、促進(jìn)嬰幼兒智力及腦發(fā)育等，尤其是其中的AA和EPA是前列腺素及衍生物的前列環(huán)素、凝血烷、白三烯的天然前體，在機(jī)體的多種生理過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，因此微藻可作為人類的高級(jí)營(yíng)養(yǎng)食品和藥品。微藻在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中還是浮游動(dòng)物(輪蟲、枝角類等)、甲殼類、雙殼類和幼齡魚類的餌料，其中含有的EPA和DHA等海產(chǎn)動(dòng)物所必需的脂肪酸(EFA)，能夠提高其生長(zhǎng)率和幼體的存活率。
海洋微藻的脂肪含量以及脂肪酸構(gòu)成的數(shù)量和質(zhì)量可隨環(huán)境因子而改變，如培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)鹽組成及比例、環(huán)境條件(光照、溫度、鹽度等)、生長(zhǎng)時(shí)期等。光照強(qiáng)度影響微藻的光合作用和生長(zhǎng)，從而對(duì)其體內(nèi)生化成分產(chǎn)生影響。關(guān)于光照強(qiáng)度對(duì)海洋微藻總脂含量和脂肪酸組成的影響已有多個(gè)報(bào)道，但國(guó)內(nèi)外對(duì)裂絲藻的研究尚未見報(bào)道。本文對(duì)1株裂絲藻和3株小球藻等4株海洋綠藻在不同光照強(qiáng)度培養(yǎng)時(shí)的相對(duì)生長(zhǎng)率、總脂含量和脂肪酸組成進(jìn)行了測(cè)定，以期找出其生長(zhǎng)和脂肪酸合成的最適光照條件，為微藻的不飽和脂肪酸研究提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料
實(shí)驗(yàn)所用微藻藻種取自中國(guó)海洋大學(xué)微藻種質(zhì)庫(kù)：小球藻；桿狀裂絲藻；光量子計(jì)，浙江托普儀器銷售。
1.2 培養(yǎng)條件
對(duì)4個(gè)藻株作了不同光照強(qiáng)度(3000lx， 5000lx， 8000lx)的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。每個(gè)光照強(qiáng)度水平設(shè)3個(gè)重復(fù)。其中海水經(jīng)沉淀后用脫脂棉過(guò)濾，煮沸消毒。采用f/2培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)于2L細(xì)口瓶中進(jìn)行，連續(xù)充氣，連續(xù)光照，光照強(qiáng)度用光量子控制，鹽度28，室溫(20±1)℃。每天用血球計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度。
1.3 微藻收獲
微藻在指數(shù)生長(zhǎng)末期4 000×g離心15 min收獲，收集的藻泥經(jīng)冷凍干燥后放入帶塞試管中，充N2氣-40℃保存。
1.4 相對(duì)生長(zhǎng)率計(jì)算
利用下式計(jì)算相對(duì)生長(zhǎng)率：
μ=(lnNt-lnN0) /T
式中，μ為每天的平均分裂速率；T為培養(yǎng)天數(shù)；N0為培養(yǎng)開始時(shí)的藻細(xì)胞數(shù)；Nt為培養(yǎng)T天后的藻細(xì)胞數(shù)。
1.5 總脂提取
總脂提取和測(cè)定按文獻(xiàn)方法進(jìn)行。
1.6 脂肪酸分析
樣品處理及氣相色譜分析按文獻(xiàn)方法進(jìn)行。取40mg左右樣品于離心管中，加入體積分?jǐn)?shù)為2∶1的氯仿/甲醇溶液，振蕩后加入1 mL 2 mol?L-1NaOH-CH3OH溶液，充分振蕩后在75℃水浴中加熱15 min進(jìn)行皂化，冷卻后加入2mol?L-1HCl-CH3OH溶液，調(diào)pH≤2，在75℃水浴中加熱15min，使其甲酯化，然后加入1mL正己烷振蕩，取上清液進(jìn)行色譜分析。
氣相色譜分析采用美國(guó)HP5890II型氣相色譜儀，氫火焰離子化檢測(cè)器，Coawax carbowax毛細(xì)管柱(30 m×Φ0. 25 mm)，進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度均為280℃，程序升溫，載氣為高純氮，流速2 mL?min-1，進(jìn)樣量1μL。以面積歸一劃法得到各脂肪酸組分的相對(duì)百分含量。
1.7 數(shù)據(jù)處理
用SPSS 13. 0軟件分別進(jìn)行單因子方差分析和多重比較。P<0. 05表示有顯著性差異。
2 結(jié)果
2.1 相對(duì)生長(zhǎng)率
本文做了不同光照強(qiáng)度對(duì)4株海洋綠藻的相對(duì)生長(zhǎng)率的影響，結(jié)果見表1。從表1可以看出，C97在中光強(qiáng)(5000lx)下獲得最大相對(duì)生長(zhǎng)率，C19、C95和C102均在高光強(qiáng)(8000lx)下獲得最大相對(duì)生長(zhǎng)率，且相對(duì)生長(zhǎng)率隨光照強(qiáng)度的增加呈增加趨勢(shì)。單因子方差分析結(jié)果表明，光照強(qiáng)度對(duì)4株綠藻的相對(duì)生長(zhǎng)率均有顯著影響(P<0. 05)。
2.2 總脂含量
本文做了不同光照強(qiáng)度對(duì)4株綠藻的總脂含量的影響，結(jié)果見表2。從表2可以看出：C19的脂肪含量在低-中光強(qiáng)(3000—5000lx)間變化不大，高光強(qiáng)下有所降低；C95的總脂含量隨光照強(qiáng)度的升高略有降低；C97和C102的總脂含量隨光照強(qiáng)度升高而明顯升高。單因子方差分析結(jié)果表明，光照強(qiáng)度對(duì)C95脂肪含量的影響沒有顯著性差異，而對(duì)C19、C97和C102的脂肪含量的影響有顯著性差異(P<0. 05)。多重比較結(jié)果表明：C19在高光照強(qiáng)度時(shí)總脂含量顯著低于其它各組，低光照強(qiáng)度和中光照強(qiáng)度處理間沒有顯著性差異(12?9%—12. 7% )； C97和C102則分別在高光照強(qiáng)度時(shí)脂肪含量顯著高于其它各組(分別為40. 6%和33. 3% )。
2.3 脂肪酸組成
本文做了3個(gè)光照強(qiáng)度水平(3000lx， 5000lx， 8000lx)對(duì)4株綠藻脂肪酸組成的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。
由表3可知， 14∶0、16∶0、16∶1(n-7)、16∶4(n-3)、18∶1(n-9)、18∶3(n-3)、AA和EPA是4株綠藻的主要脂肪酸成份。小球藻C95的EPA含量在中低光照強(qiáng)度下含量較高，C97和C102的EPA含量隨光照強(qiáng)度的增加而明顯降低， SFA和MUFA總量隨光照強(qiáng)度的增加總體呈增加趨勢(shì)。桿狀裂絲藻C19的EPA含量隨光照強(qiáng)度的增加呈現(xiàn)低—高—低趨勢(shì)， SFA隨光照強(qiáng)度的增加呈降低趨勢(shì)，MUFA隨光照強(qiáng)度的增加呈增加趨勢(shì)。4株綠藻的20∶4n-6含量和PUFA總量均隨光照強(qiáng)度的增加而降低。
單因子方差分析結(jié)果表明：光照強(qiáng)度對(duì)C19的14∶0、16∶0、EPA含量及SFA、MUFA和PUFA總量的影響有顯著性差異(P<0. 05)，對(duì)其他脂肪酸含量的影響沒有顯著性差異；光照強(qiáng)度對(duì)C95的16∶1(n-7)、AA、EPA含量及MUFA和PUFA總量的影響有顯著性差異(P<0. 05)，對(duì)其他脂肪酸含量的影響沒有顯著性差異；光照強(qiáng)度對(duì)C97的16∶0、16∶1(n-7)、16∶4(n-3)、18∶3(n-3)、EPA含量及SFA和PUFA總量的影響有顯著性差異(P<0. 05)，對(duì)其他脂肪酸含量的影響沒有顯著性差異；光照強(qiáng)度對(duì)C102的14∶0、16∶1(n-7)、16∶4(n-3)、EPA含量及SFA、MUFA和PUFA總量的影響有顯著性差異(P<0. 05)，對(duì)其他脂肪酸含量的影響沒有顯著性差異。
多重比較結(jié)果表明，C19的EPA含量在中光照強(qiáng)度水平顯著高于其它處理(12.7% )，低光照強(qiáng)度和高光照強(qiáng)度處理間沒有顯著性差異；C95的EPA含量在高光照強(qiáng)度水平顯著低于其它處理，低光照強(qiáng)度和中光照強(qiáng)度處理間沒有顯著性差異(14.0%—14.7% )；C97和C102的EPA含量分別在低光照強(qiáng)度水平顯著高于其它處理(分別為12.0%和10.5% )。C19的16∶0含量和C95的AA含量在低光照強(qiáng)度水平顯著高于其它處理；C19、C95和C102的16∶1n-7含量、C97的16∶0含量均在高光照強(qiáng)度水平顯著高于其他處理，低光照強(qiáng)度和中光照強(qiáng)度處理間沒有顯著性差異；C19的AA含量在低光照強(qiáng)度水平顯著高于其它處理，中光照強(qiáng)度和高光照強(qiáng)度處理間沒有顯著性差異；C97的16∶1(n-7)含量在低光照強(qiáng)度水平顯著低于其它處理，中光照強(qiáng)度和高光照強(qiáng)度處理間沒有顯著性差異；C95和C102的18∶1(n-9)含量在中光照強(qiáng)度和高光照強(qiáng)度處理間有顯著性差異，其它處理間沒有顯著性差異；C97的AA含量和C102的16∶0含量在低光照強(qiáng)度和高光照強(qiáng)度處理間有顯著性差異，其它處理間沒有顯著性差異。4株綠藻的16∶4(n-3)、18∶2(n-6)和18∶3(n-3)含量較低。C19的SFA和PUFA總量分別在高光照強(qiáng)度水平顯著低于其它處理，在低光照強(qiáng)度和中光照強(qiáng)度處理間沒有顯著性差異(分別為41. 9%—42. 1%和19. 1%—19. 4% )；MUFA總量則在低光照強(qiáng)度水平顯著低于其它處理，在中光照強(qiáng)度和高光照強(qiáng)度處理間沒有顯著性差異(38.6%—39.2% )。在高光照強(qiáng)度水平，C97和C102的SFA總量(分別為42. 2%和43. 0% )及C95和C102的MUFA總量(分別為39.8%和42.3% )均顯著高于其它處理； C97和C102的PUFA總量均在低光照強(qiáng)度水平顯著高于其它處理(分別為19.2%和18.9% )，C95的PUFA總量則在高光照強(qiáng)度水平顯著低于其它處理，在低光照強(qiáng)度和中光照強(qiáng)度處理間保持穩(wěn)定(均為21.3% )。
3 討論
微藻的脂肪酸組成在不同的培養(yǎng)條件下可能會(huì)有所變化，但仍保持其特殊的特征。綠藻綱富含16碳和18碳PUFAs，其特征脂肪酸是16∶4(n-3)和18∶3(n-3)，一些海產(chǎn)小球藻種有著較高含量的EPA，大多數(shù)的綠藻種類都僅含有少量的DHA或不含。在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中， 4株海洋綠藻的主要脂肪酸組成為14∶0、16∶0、16∶1(n-7)、16∶4(n-3)、18∶1(n-9)、18∶3(n-3)、AA和EPA，與前人的研究結(jié)果相符。
微藻的脂類物質(zhì)包括中性脂(三酰甘油)和極性脂(磷脂和甘油脂)，三酰甘油通常含有更多的飽和與單不飽和脂肪酸，甘油脂則含有較多的PUFAs，磷脂的含量相對(duì)穩(wěn)定。微藻細(xì)胞隨環(huán)境變化而改變各類脂的比例，從而也改變了脂肪酸的組成，光是其中最重要的因子之一。在Thompson等的研究結(jié)果中，球等鞭金藻的總脂含量在較低光強(qiáng)取得最大值，綠色巴夫藻的總脂含量則隨光照強(qiáng)度的增加(1120—18000lx)由低—高—低—高變化，在3520lx和18000lx光強(qiáng)下總脂含量最高。李荷芳等的結(jié)果表明小球藻的脂肪含量與光照強(qiáng)度呈正相關(guān)，而前溝藻的脂肪含量隨光照強(qiáng)度的升高反而下降。石娟等和EmdadiD等的研究也表明微藻在低光照下脂肪含量較高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，C19的脂肪含量在高光強(qiáng)下有所降低，C95的總脂含量隨光照強(qiáng)度變化不大， C97和C102的總脂含量則隨光照強(qiáng)度升高而明顯升高，表明微藻的脂肪含量隨光照強(qiáng)度的變化因種而異。
早期的研究結(jié)果表明光照強(qiáng)度的增加有利于海洋微藻16碳和18碳PUFAs的形成，主要是16∶2(n-6)，16∶3(n-6)， 16∶4(n-3)， 18∶2(n-6)和18∶3(n-3)，LeeYK等的結(jié)果也表明紫球藻的18∶2、20∶4和20∶5含量隨光照強(qiáng)度的增加而增加， Seto等的結(jié)果表明微小小球藻的EPA含量隨光照強(qiáng)度的增加略有增加。但更多的研究表明，生長(zhǎng)在高光強(qiáng)條件下的微藻不飽和脂肪酸的比例降低。Renaud等認(rèn)為這是由于不同的微藻細(xì)胞中存在不同類型的去飽和酶，而這些酶的活性受光強(qiáng)的影響不同，并研究了不同光照條件下等鞭金藻和微綠球藻的脂肪酸組成，結(jié)果顯示，Isochrysissp.的EPA等幾種PUFA含量和N. oculata中的16∶2(n-4)、18∶3(n-3)、EPA含量及PUFA總量均隨光照增加而下降。在Sukenik等的研究結(jié)果中微綠球藻的AA、EPA含量、Molina-Grima等的研究結(jié)果中I. galbana的EPA含量以及Mortenson等的結(jié)果中纖細(xì)角毛藻(Chaetocerosgracilis)的16∶2(n-7)、18∶1(n-9)、18∶2(n-6)、18∶4(n-3)、AA和DHA含量均在高光強(qiáng)下比例降低，Thompson等的結(jié)果顯示當(dāng)光強(qiáng)從18000lx下降到480lx時(shí)，簡(jiǎn)單角毛藻中的EPA從6.1%增加到15.5%，而DHA從9.7%減少到3.6%。孫利芹等的研究結(jié)果表明中低光照有利于紫球藻AA和EPA的積累。廖啟斌等對(duì)三角褐指藻和小球藻、徐年軍等等對(duì)后棘藻、蔣霞敏對(duì)微綠球藻和綠色巴夫藻、繆錦來(lái)等對(duì)兩種南極綠藻以及LiangY等對(duì)三角褐指藻等6株海洋硅藻的研究中也發(fā)現(xiàn)PUFAs含量隨光強(qiáng)的增加而呈下降趨勢(shì)。
在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，小球藻C95的EPA含量在中低光照強(qiáng)度下含量較高，分別為14.0%和14.7%，高光照下降低至7. 3%，與孫利芹等的研究結(jié)果相似；C97和C102的EPA含量隨光照強(qiáng)度的增加而明顯降低，C97從12. 0%降至8.1%，C102從10. 5%降至6. 2%，與Thompson等、Renaud等、Sukenik等、Grima等和Mortenson等的結(jié)果相似。C19的EPA含量隨光照強(qiáng)度的增加呈現(xiàn)低—高—低趨勢(shì)(9. 1%—12.7%—9.0% )，表明桿狀裂絲藻在中等光照強(qiáng)度下能夠獲得EPA的最大值。4株綠藻的AA含量均隨光照強(qiáng)度的增加而降低，與Sukenik等和Mortenson等的結(jié)果一致，4株綠藻的PUFA總量均隨光照強(qiáng)度的增加而降低，與廖啟斌等、徐年軍等、蔣霞敏、繆錦來(lái)等及LiangY等的結(jié)果一致。產(chǎn)生這種變化的原因一方面可能是由于微藻細(xì)胞在高光照條件下生長(zhǎng)快速，體內(nèi)的PUFA得不到足夠的積累所致；另一方面還可能跟細(xì)胞內(nèi)光合作用的機(jī)構(gòu)有關(guān)，微藻細(xì)胞內(nèi)的光合作用在葉綠體的類囊體膜上進(jìn)行，富含PUFA的甘油脂是類囊體膜的主要組分，其數(shù)量與細(xì)胞的光合活力密切相關(guān)。低光照條件下，為了增加光吸收及光利用效率，膜脂的合成速率維持在較高水平，類囊體膜的表面積有所增加，因而PUFA含量增加。而當(dāng)光強(qiáng)超過(guò)飽和光強(qiáng)時(shí)，引起了光合機(jī)構(gòu)的損傷和光合速率的下降，膜脂合成速率降低，甚至受到破壞， PUFA含量隨之下降。
